Resumo do Projeto.

O parasita Leishmania é o causador da leishmaniose. Essa doença afeta cerca de 12 milhões de pessoas, a maioria vivendo em países subdesenvolvidos. É considerada um problema de saúde mundial pela O.M.S. (Organização Mundial de Saúde). Os estudos bioquímicos e de biologia molecular podem ajudar no entendimento da biologia do parasita e, assim, colaborar para o combate à doença.

Os objetivos do projeto foram identificar, clonar e expressar proteínas da fração vesicular das formas promastigotas de Leishmania major e Leishmania amazonensis. A etapa inicial desse estudo consistiu no fracionamento das formas promastigotas para o enriquecimento das amostras com a fração vesicular. Após a ruptura das vesículas, as proteínas solúveis foram separadas por géis unidimensional e bidimensional e analisadas por espectrometria de massa. ESI-MS/MS e MALDI-TOF/MS foram usadas para identificação das proteínas através do mapeamento das massas de peptídeos tripsínicos (“peptide mass fingerprint”, PMF). Essa técnica possibilitou a análise de 74 “spots” de proteínas, resultando na identificação de 28 deles.

A identificação das proteínas presentes no extrato solúvel de vesículas possibilitou a seleção de três, possivelmente secretadas, como alvos de estudo para investigação de suas funções na biologia da Leishmania. Foram selecionadas: a Nucleosídeo Difosfato Kinase b (NDKb), a Protease Calpaína-like (CLP) e a Carboxipeptidase Termoestável (TCP). As seqüências codificadoras foram obtidas por PCR de DNA genômico de L. major  e clonadas nos vetores pT7T3 e pET28a. As construções em pET28a foram usadas para a expressão das proteínas em E. coli BL21(DE3)pLysS que expressou duas proteínas solúveis, a NDK e a CLP, e uma insolúvel, a TCP. As três proteínas tiveram bons níveis de expressão. As proteínas NDK e CLP foram parcialmente purificadas por cromatografia de afinidade. As proteínas NDK e TCP, expressadas em E. coli, tiveram sua identificação confirmada por ESI-MS/MS.